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Valutazione In Vitro Della Risposta Di Cellule Infiammatorie A Viti Da Impianto Con Differenti Superfici Implantari

Autori: DR. FABIO COLOMBELLI DR. MARCO MORRA DR.SSA CLARA CASSINELLI DR. DANIELE BOLLATI

Riassunto

Lo scopo del lavoro è stata la valutazione della risposta infiammatoria in vitro a superfici implantari differenti sulla base dello stesso trattamento, per valutare quale fattore influenzasse lo sviluppo di tale risposta infiammatoria e quindi per analizzare un possibile fattore in vivo dello sviluppo di mucositi implantari o perimplantiti vere e proprie. Sulla base del protocollo di riferimento utilizzato per il trattamento e l’analisi dei dati ottenuti, si ritiene di poter valutare che in vitro la risposta infiammatoria sia dipendente dalla presenza di endotossine sulle superfici implantari più che dalla topografia della superficie.

Introduzione

Il problema delle perimplantiti La chirurgia implantare è sempre più utilizzata per la sostituzione di elementi dentali mancanti, per cui una percentuale crescente di individui risulta essere portatore di impianti osteointegrati. È però anche noto che una delle problematiche principali che affliggono l’impianto è l’insorgenza della perimplantite. Le alterazioni patologiche a carico dei tessuti perimplantari si distinguono.

Scopo del lavoro

Lo scopo del lavoro è infatti stata la valutazione, mediante analisi RT-PCR, della risposta di cellule infiammatorie a viti da impianto in titanio provenienti da diversi fornitori e con diversa superficie. In particolare, lo scopo è stato quello di misurare l’espressione, da parte di macrofagi in coltura, di alcuni geni-chiave coinvolti nel processo di infiammazione, utilizzando un protocollo in vitro sviluppato recentemente per analizzare la risposta infiammatoria a stimoli della superficie. I nomi commerciali delle viti da impianto vengono omessi in quanto per il risultato del nostro lavoro la discriminante fondamentale risulta essere la diversa morfologia e struttura della superficie implantare, indicata nell’analisi delle viti-campione.

Materiali e metodi

I campioni valutati in questo lavoro sono stati i seguenti. La lettera indica un tipo di vite implantare e il numero il numero di campioni analizzati per quella stessa vite.

A1 Soadco KLOCKNER 3.8 x 14 2835 B 384 (SABBIATO E ACIDIFICATO) A2 Soadco KLOCKNER 3.8 x 14 2835 B 384 (SABBIATO E ACIDIFICATO) B Sweden & Martina KONHO 4.25 x 13 0000048718 (ACIDIFICAZIONE con Ossido di Zirconio) C1 Implant Direct LEGACY 3.7 x 10 37052 (HA IDROSSIAPATITE RIVESTITO) C2 Implant Direct LEGACY 3.7 x 10 44230 (HA IDROSSIAPATITE RIVESTITO) D1 Prodent Italia PRIME 4.6 x 8.5 017013 (DOPPIA ACIDIFICAZIONE) D2 Prodent Italia PRIME 4.6 x 8.5 017013 (DOPPIA ACIDIFICAZIONE) E1 Bego SEMADOS 5.5 x 10 904351 (SABBIATO E ACIDIFICATO) E2 Bego SEMADOS 5.5 x 10 904351 (SABBIATO E ACIDIFICATO) F1 Zimmer TSVTB10 3.7 x 10 62176820 (SABBIATURA CON CRISTALLI IDROSSIAPATITE + rivestimentoHA) F2 Zimmer TSVTB10 3.7 x 10 62176820 (SABBIATURA CON CRISTALLI IDROSSIAPATITE + rivestimentoHA) F3 Zimmer TSVWH10 4.7 x 10 66218026 (SABBIATURA CON CRISTALLI IDROSSIAPATITE) F4 Zimmer TSVWH10 4.7 x 10 66218026 (SABBIATURA CON CRISTALLI IDROSSIAPATITE) G1 Geass WAY Milano 3.8 x 13 13P004140980000 (LASERIZZATO) G2 Geass WAY Milano 3.8 x 13 13P004140980000 (LASERIZZATO) G3 Geass WAY Milano 5.5 x 13 12P000853710000 (LASERIZZATO)

Tutti i campioni erano in confezione sigillata ed in condizioni di sterilità. Le confezioni sono state aperte immediatamente prima del test, sotto una cappa a flusso laminare Faster BIO 48 (DASIT), nel nostro laboratorio di colture cellulari. Non è stato possibile analizzare alcuni campioni perché non è stato possibile rimuovere il dispositivo di montaggio in maniera semplice (per questo sono indicati in tabella con sfondo grigio). Operazioni di rimozione “forzata” avrebbero potuto introdurre contaminazione e rendere il dato non affidabile. Per valutare la risposta infiammatoria e’ stata eseguita una misura di espressione genica mediante RT-PCR. Le prove sono state eseguite mediante la valutazione dell’espressione da parte di macrofagi J774A-1 di alcuni geni-chiave della risposta infiammatoriam in particolare, Interleuchina 1beta (IL-1beta) e interleuchina 6 (IL-6). Il metodo analitico e’ stato il seguente: abbiamo recentemente dimostrato che l’espressione dei geni citati da parte della linea cellulare menzionata e’, a breve tempo (4 h), controllata sostanzialmente dal livello di endotossine adese ed e’ indipendente dalla natura del materiale (J Oral Implantol. 2012 Nov 12. [Epub ahead of print], Adherent endotoxin on dental implant surfaces: a reappraisal, Morra M, Cassinelli C, Cascardo G, Bollati D, Bellanda M). Sulla base di questa osservazione, la quantita’ di endotossine adese e la risposta immediata infiammatoria possono essere misurate controllando la risposta trascrizionale di macrofagi J774A-1 a tempi brevi sulle superfici da analizzare. Le misure sono state eseguite come segue: una sospensione di 1.35±0.18 x 105 cellule J774A-1, coltivate in terreno DMEM contenente L-glutamina (Gibco, INVITROGEN S.r.l), 20% Foetal Bovine Serum (FBS Gibco, INVITROGEN S.r.l), penicillina e streptomicina (Gibco, INVITROGEN S.r.l ) e’ stata introdotta in micropiastre a 12 pozzetti sterili in polistirene (12- well multiwell plates, Cell Star, Greiner One™), che contenevano i campioni. L’analisi di espressione genica e’ stata condotta utilizzando real time reverse transcription PCR (qRT-PCR). L’RNA totale e’ stato estratto dopo 4 h, utilizzando il MagMax Total RNA Isolation Kit (Applied Biosystems). La qualita’ dell’RNA e’ stata valutata controllando che il rapporto A260/A280 fosse tra 1.6 e 2.0. L’RNA estratto e’ stato in seguito retro-trascritto per ottenere cDNA utilizzando l’ Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription kit. La quantificazione relativa dei geni e’ stata ottenuta utilizzando sonde Taq Man specifiche per ogni gene valutato e GAPDH come gene di riferimento. Per ogni tipologia sono stati utilizzati cinque campioni, ad eccezione del riferimento che era singolo. In questo caso, le reazioni di amplificazione sono state eseguite in triplicato da tre aliquote del medesimo campione, per poter valutare almeno l’accuratezza intraesperimento. L’amplificazione e’ stata condotta utilizzando un termociclatore StepOne (Applied Biosystems) secondo le istruzioni del produttore. I grafici di espressione genica sono stati ottenuti normalizzando i dati utilizzando il software StepOne, secondo il metodo standard ∆Ct.

Risultati

I risultati delle misure di espressione genica sono riportati nel grafico sottostante. In particolare, i dati mostrano quante volte e’ variata l’espressione di un dato gene rispetto a quanto misurato sul campione di riferimento, cioè il polistirene per colture cellulari utilizzato per la crescita delle cellule, a seguito del contatto tra cellule infiammatorie e superficie implantare. Per questo motivo, l’espressione misurata sul campione di riferimento e’ sempre uguale a 1

 

Il grafico mette immediatamente in evidenza come i campioni Klockner prodotti da Soadco siamo decisamente piu’ pro-infiammatori rispetto a tutti gli altri campioni. Infatti l’espressione delle due interleuchine e’ maggiore di 20-30 volte rispetto a quanto avviene quando le cellule incontrano la superficie del riferimento o la superficie di alcuni degli impianti analizzati in questo esperimento. I rimanenti impianti sono tutti mediamente buoni, in quanto la sovraespressione di geni infiammatori e’ al massimo attorno alle 5 volte. Nella figura sottostante e’ riportato quanto avevamo trovato nell’articolo citato, che e’ alla base del metodo analitico adottato, e che evidenzia frequenti sovraespressioni anche di 20 volte e piu’ dei geni in esame (nella figura si tratta di IL-6, che sulla base della nostra esperienza e’ il gene con maggiore sensibilita’ alla presenza di endotossine, quindi confrontabile con il grafico riportato nella parte destra del grafico dei risultati)